蔡伦出身于东汉初年大凑山下从事冶铸的一个铁匠世家，他的祖上是打铁的。卫飒上任桂阳郡太守后，在桂阳设置铁官，蔡家因此与朝廷官员有了紧密的联系。

小时候，他在大凑山麓一处被称作石林的乡学启蒙读书，习《周礼》，读《论语》，尤其对周边的生产、生活环境很感兴趣，比如冶炼、铸造，种麻、养蚕。少年蔡伦，已经是满腹经纶，很有才学。

根据蔡伦后人的传说，蔡伦是在18岁以后，由京城到桂阳管理调运采冶铸铁的官员推荐，才进皇宫做了宦官。这一年，是汉明帝永平十八年（公元75年）。从史料分析，蔡伦是中国华南地区甚至江南地区第一位走进朝廷，进入皇宫为官的人。

他被选入宫后，开始是在皇宫旁舍嫔妃所居的掖庭当差，几年后提升为出入皇宫、传递诏令的小黄门宦官。蔡伦的才华越来越显露出来。系奉窦皇后之命监管宋贵人之事，建初七年，窦后设计诬陷宋贵人，蔡伦“验实”。到汉和帝即位时（公元89年），升迁为出入朝廷、侍从天子的中常侍，豫参帷幄之中，成了传达诏令、掌理文书、参预朝政的高等宦官。

汉和帝刚登上皇帝宝座时，年龄尚幼，蔡伦曾服侍过的窦皇后成为皇太后，把持朝政，皇权旁落外戚窦氏家族。窦太后的同胞窦宪等四个兄弟都为显贵，擅威权，谋不轨，炎势倾朝野。心性秉直的蔡伦看不惯这些，便与大宦官钩盾令郑众首谋，扶助和帝，乘窦宪出征班师回朝之机，收窦宪大将军印，清除了窦氏专权的弊端，巩固了和帝的皇权统治。

永元九年（公元97年），“监作秘剑及诸器械”；此前，由中常侍“加位尚方令” 。

元兴元年（公元105年）向汉和帝献纸[7] 这种纸被称为“蔡侯纸”。

元初元年（公元107年），邓太后因为蔡担任了很长时间的侍卫，封他为龙亭侯，封地有三百户人口。后来担任长乐太仆（官职名）。元初四年（公元110年），皇帝因为经史传记等文字大多都没有核实确定，于是选拔有名的读书人谒者（学官名）刘珍以及博士（学官名）良史（史官名）聚集在东观（宫殿名），校正各种典籍，派蔡伦监督这件事情。

建光元年（公元121年）邓太后卒，安帝亲政。蔡伦因为当初受窦后指使参与迫害安帝祖母宋贵人致死、剥夺刘庆的皇位继承权而被审讯查办。下令让蔡伦自己到廷尉（法官名）那里认罪。蔡伦耻于受辱，于是沐浴后穿戴整齐衣服、帽子，喝毒药而死。他的封地被废除（收回）。