唐朝统一过程中，李世民功勋卓著，威胁到李建成的太子地位，引起李建成不安。李建成勾结齐王李元吉，数次加害李世民，李世民的幕僚都非常忧惧。房玄龄对长孙无忌道：“如今两方已经结怨，一旦祸患暗发，不只是秦王府难以收拾，便是国家存亡都成问题。不如劝说秦王行周公之举，安定家国。”长孙无忌道：“我早就有这想法了，只是一直不敢说，你的话正和我的心意。”于是，长孙无忌与房玄龄、杜如晦一同劝说李世民先发制人，诛杀李建成与李元吉。

武德九年（626年），李建成向李渊进谗，将房玄龄、杜如晦逐出秦王府，李世民的心腹幕僚只剩长孙无忌。长孙无忌坚决支持房玄龄政变的动议，与舅父高士廉和秦王府部将侯君集、尉迟敬德等人日夜劝说李世民，让他诛杀太子与齐王。李世民仍犹豫不决。这时，李建成以反击突厥侵犯为名，推荐李元吉督军北征，又抽调秦王府精兵猛将，并计划在饯行时伏杀李世民。李世民得知，遂决定发动兵变，命长孙无忌将房玄龄、杜如晦秘密召回，一同谋划。

同年六月，李世民率长孙无忌、尉迟敬德、侯君集、张公谨、刘师立、公孙武达、独孤彦云、杜君绰、郑仁泰、李孟尝等人埋伏在玄武门，成功诛杀李建成、李元吉。不久，唐高祖册立李世民为皇太子，任命长孙无忌为太子左庶子。八月，李世民继位，是为唐太宗，册妻子长孙氏为皇后。长孙无忌改任左武侯大将军。后来，罗艺在幽州反唐，长孙无忌又担任行军总管，征讨罗艺。